Понимание совместного метаболизма лекарственных средств

О потенциале применения трансгенных микроорганизмов для производства стандартных образцов метаболитов лекарственных средств и метаболического картирования.

Разработка лекарственных средств является комплексным процессом, включающим не только поиск новых молекул, обладающих заданной — биологической активностью, но и выявление на ранних этапах разработки определенных рисков, связанных с эффективностью и безопасностью. Это относится как к инновационным, так и воспроизведенным (генерическим) лекарственным средствам.

Основными задачами, требующими особого внимания при разработке лекарственного средства, являются:

1. Доказательство биоэквивалентности — для генерических лекарственных средств;
2. Поиск возможных метаболитов — для инновационных молекул.

Исследования и доказательство биоэквивалентности пероральных лекарственных форм является обязательным условием разработки и регистрации генерических лекарственных средств.[1]

Зачастую, такие исследования выполняются у здоровых добровольцев и фармакокинетический профиль лекарственного препарата строится по результатам определения концентрации активного ингредиента в плазме крови во времени.[2]

Таблица 1. Задачи и применяемые модели метаболизма в исследовательских целях

Для активных ингредиентов, подвергающихся быстрому метаболизму в организме, применяют также метод определения первичных метаболитов в плазме крови, кроме того, если известно, что исследуемое лекарственное вещество подвергается биотрансформации, контролируемой генетически полиморфными изоферментами цитохрома Р-450 (CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6), для снижения вариабельности фармакокинетических параметров целесообразно генотипирование добровольцев с целью исключения участия в исследовании лиц с генотипами «медленного» и «быстрого» метаболизма.

С этой целью широкое применение нашли стандартные образцы первичных метаболитов активных фармацевтических ингредиентов (АФИ), используемые как на стадии разработки аналитических методик, так и на стадии биоаналитических испытаний.

Метаболическое картирование или метаболический профиль АФИ — это исследование, позволяющее на ранних этапах разработки инновационных лекарственных средств предсказать направление метаболизма АФИ, выявить активные метаболиты, определить метаболическую устойчивость, либо наоборот, выбрать про-лекарство в качестве основной молекулы-кандидата для разработки и исследований.

Любая из указанных задач, будь то синтез определенного метаболита, или исследование метаболического профиля АФИ сводится к селективному введению функциональных групп в молекулу.

Задача селективного введения функциональных групп в органическом синтезе до сегодняшнего дня имеет важное значение. Многие научные коллективы разрабатывают специфические катализаторы окисления химических соединений в определенное положение углеродной цепи, однако, до настоящего времени, эти решения трудоемки, и не могут быть воспроизведены с целью коммерческого производства.[3]

Таблица 2. Цитохром-Р-450 катализируемые превращения прокариот [11 — 16]

Другим методом является выделение специфических ферментных систем, включающих цитохромы, оксигеназы, редуктазы, позволяющие моделировать процесс метаболизма лекарственных средств. Отличительной особенностью данной техники является специфичность и селективность, однако требования к условиям проведения экспериментов, конформационная нестабильность ферментов, необходимость функционирования ферментативных комплексов, делает такие подходы мало продуктивными, и используется в основном как модели для фундаментальных исследований.[4]

Наиболее перспективный путь наработки метаболитов — использование рекомбинантных клеточных культур, позволяющий соединить в одной клетке (бактерий или одноклеточных дрожжей) всю цепочку ферментов, и использовать собственные инструменты и механизмы клетки для обеспечения процессов ферментативного метаболизма активных фармацевтических ингредиентов.[5]

Принцип использования микроорганизмов для селективного синтеза стереоизомеров не является новым. Примером являются работы Нейберга и Хирша по превращению бензальдегида в (-)-фенилацетилкарбинол еще в 1921 году.

На сегодняшний день в мире накоплено достаточно экспериментальных данных для направленного синтеза производных лекарственных средств с использованием рекомбинантных микроорганизмов, экспрессирующих широкий спектр цитохромов, таких как CYP3A4, CYP2D6, CYP2C17, редуктаз, таких как стероид-5-альфаредуктаза, дегидрогеназ, как 20-ГСД и других ферментов.[6-8]

Это достаточно широкая группа ферментов, отвечающая в организме за различные функции, в том числе и метаболизм ксенобиотиков, включая лекарственные средства, токсины и загрязняющие агенты, а также метаболизм эндогенных веществ, таких как стероиды и простагландины.[9, 10]

Таблица 3. Цитохром-Р-450 катализируемые превращения эукариот [11 — 16]

Концептуально ферменты, метаболизирующие лекарственные средства, делятся на две группы:

• Ферменты фазы I катализируют (в основном окислительные) реакции, которые обычно приводят к введению функциональной группы в молекулы субстрата. Семейства ферментов фазы I включают цитохромы P450 (CYP) и флавин-зависимые монооксигеназы (FMO), но также моноаминоксидазы (MAOs), дегидрогеназы, изомеразы, гидролазы и другие.
• Ферменты фазы II катализируют конъюгативные реакции, которые обычно приводят к образованию растворимых соединений, которые легче выводятся из организма.

Ферменты семейства II фазы включают UDP-глюкуронозилтрансферазы (UGT), глутатионтрансферазы (GST), сульфотрансферазы (SULT) и N-ацетилтрансферазы (NAT).

С точки зрения промышленности, задачи, перечисленные в таблице 1, могут быть определены в связи с направлением исследований in vitro метаболизма лекарств и биологическим объектом для изучения метаболитов лекарственных средств. Выбор биокатализатора(-ов) диктуется решаемыми задачами.

В качестве субстратов могут применяться:

• Прототипы лекарственных препаратов / лекарственные препараты
• Биологически активные продукты природного происхождения
• Полусинтетические производные биологически активных продуктов природного происхождения.

Таблица 4. Цитохром-Р-450 катализируемые превращения в рекомбинантных микроорганизмах (отдельные представители) [17 – 23]

Развитие фармацевтической отрасли неизбежно способствует росту потребности в стандартных образцах, особенно применяемых в аналитических этапах различных фаз клинических испытаний. Основным направлением разработки отечественных фармпредприятий является комбинирование препаратов различных фармакотерапевтических групп для достижения эффекта синергии в лечении хронических заболеваний [24]. При этом понимание совместного метаболизма лекарственных средств и влияние на их эффективность и безопасность становится ключевой задачей как на этапе разработки нового препарата, так и на этапе клинических испытаний.

В этом контексте, трансгенные рекомбинантные микроорганизмы становятся не только востребованными продуцентами метаболитов, но и отличной моделью для изучения взаимодействия лекарственных средств. ГК Фармконтракт со своей стороны стремится предугадывать потребности своих клиентов, и готовы предложить проектирование, строительство и оснащение «под ключ» объектов, предназначенных для разработки и культивирования штаммов микроорганизмов как в научно-исследовательских, так и в промышленных целях.

Комплекс поставляемого оборудования включает эксклюзивные предложения от мировых лидеров в области прецизионных аналитических систем (Agilent, Brucker, Beckman Coulter ), систем лабораторного, пилотного и промышленного культивирования микроорганизмов (Sartorius, Millipore, Inforce, Inoxpa), климатического оборудования различного назначения и инкубаторы (Binder, GFL), оборудования для молекулярно-биологических и генетических исследований (Beckman Coulter, Bio-RAD) систем выделения и очистки продуктов (Millipore), и другого лабораторного и промышленного оборудования.

Источники информации

1. Федеральный закон N61-ФЗ «Об обращении лекарственных средств»
2. Оценка биоэквивалентности лекарственных средств. Методические указания Министерства здравоохранения и социального развития РФ от 12.05.2008
3. Jorge A.R. Salvador, et al, Current Organic Chemistry 10(17):2227-2257
4. Tsutomu Shimada, Hiroshi Yamazaki, Cytochrome P450 Reconstitution Systems/ Cytochrome P450 Protocols, DOI 10.1385/0896035190
5. Gillam, E. M. (1998), Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology, 25: 877–886. doi:10.1111/j.1440-1681.1998.tb02338.x
6. GEIER M, Chemistry Today — vol. 31(3) May/June 2013
7. Dietrich M1, et al, Chembiochem. 2005 Nov; 6(11):2014-22
8. Shkumatov V, et al . Prikl Biokhim Mikrobiol. 2006 Sep-Oct;42(5):539-46
9. Guengerich, F.P. Human cytochrome P450 enzymes. In: Ortiz de Montellano, P.R., ed. Cytochrome P450: Structure, Mechanism, and Biochemistry, 3rd edn.New York: Springer, 2005, pp. 377-530
10. Parkinson, A. Biotransformation of xenobiotics. In: Klaassen, C.D., ed. Casarett and Doull’s Toxicology: The Basic Science of Poisons, 6th edn. New York: McGraw-Hill, 2001, pp. 133-224
11. Sariaslani, F.S. Microbial cytochromes P-450 and xenobiotic metabolism. Adv Appl Microbiol 1991, 36, 133-178.
12. Rosazza, J.P., Smith, R.V. Microbial models for drug metabolism. Adv Appl Microbiol 1979, 25, 169-208
13. Sewell, G.J., Soper, C.J., Parftt, R.T. The screening of some microorganisms for their ability to N -dealkylate drug molecules. Appl Microbiol Biotechnol 1984, 19, 247-251
14. Smith, R.V., Davis, P.J. Induction of xenobiotic monooxygenases. Adv Biochem Eng 1980, 14, 61-100
15. Azerad, R. Microbial models for drug metabolism. Adv Biochem Eng/Biotechnol 1999, 63, 169-218
16. Srisilam, K., Veeresham, C. Biotransformation of drugs by microbial cultures for predicting mammalian drug metabolism. Biotechnol Adv 2003, 21, 3-39
17. B.B. Palma, C.W. Fisher, J. Rueff, M. Kranendonk, Prototype systems containing human cytochrome P450 for high throughput real-time detection of DNA damage by compounds that form DNA-reactive metabolites, Chem. Res. Toxicol. 29 (2016) 747–756
18. Paul Quehl, Joel Hollender, Jan Schüürmann, Tatjana Brossette, Ruth Maas and Joachim Jose Co-expression of active human cytochrome P450 1A2 and cytochrome P450 reductase on the cell surface of Escherichia coli , Microbial Cell Factories, 2016, Volume 15, Number 1, Page 1
19. Pavel Soucek Expression of Cytochrome P450 2A6 in Escherichia coli Archives of Biochemistry and Biophysics Vol. 370, No. 2, October 15, pp. 190 –200, 1999
20. Nobumitsu Hanioka, Kimiaki Matsumoto, Yoshiro Saito and Shizuo Narimatsu, Functional Characterization of CYP2C8.13 and CYP2C8.14: Catalytic Activities toward Paclitaxel, Nordic Pharmacological Society. Basic & Clinical Pharmacology & Toxicology, 107, 565–569
21. K.N. Purnachandra Rao, Sunil Kumar Suman, Y. Ravi Kiran, Co-Expression of Recombinant Human CYP2C9 with Human Cytochrome P450 Reductase in Protease Defcient S. cerevisiae Strain at a Higher Scale Yields an Enzyme of Higher Specifc Activity, Drug Metabolism Letters, 2010, 4, 246-253
22. Matthias Dietrich, Lisa Grundmann, Katja Kurr, Laura Valinotto, Tanja Saussele, Rolf D. Schmid and Stefan Lange, Recombinant Production of Human Microsomal Cytochrome P450 2D6 in the Methylotrophic Yeast Pichia pastoris
23. Michael Fasullo, Julian Freedland, Nicholas St. John, Cinzia Cera, Patricia Egner, Matthew Hartog and Xinxin Ding, An InVitro System for Measuring Genotoxicity Mediated by Human CYP3A4 in Saccharomyces cerevisiae, Environmental and Molecular Mutagenesis 2017 May;58(4):217-227
24. Михаил Гетьман, Локализация, как форма трансфера знаний, опыта и навыков, «Новости GMP», 1(12) 2017

Автор материала:  Константин Фроленков,
руководитель направления синтез субстанций ГК «Фармконтракт» 

Материал опубликован в журнале «Новости GMP» №3 (14) осень 2017