Технологию микрочипа, которая используется в молекулярной биологии, можно представить, как множество микро-лабораторий, в которых одновременно происходит множество биохимических реакций.
В 2012 году в ГК Алкор Био был разработан собственный вариант технологии микрочипа, которая позволяет объединить большое число исследований в один процесс. Это сокращает время анализа и позволяет в короткие сроки получить информацию, важную для выявления особенностей генома человека или другого организма. Время часто играет важную роль, например, при проведении скрининга новорожденных с целью выявления частых генетических заболеваний. ГК Алкор Био реализовала проект по выявлению мутаций в гене CFTR для определения носительства и для диагностики муковисцидоза, и теперь сотрудники научно-исследовательской лаборатории работают над созданием системы для типирования локусов человеческого лейкоцитарного антигена (Human Leukocyte Antigen — HLA), которая может быть использована в первую очередь в области гематологии и трансплантологии, для изучения гистосовместимости доноров костного мозга и других органов и тканей.
Понятие «гистосовместимость» означает выживание и функционирование клеток, тканей и органов одного организма в другом организме.
Когда в организм попадает любой чужеродный белок, он становится антигеном. За определение «свой — чужой» отвечают антигенпрезентирующие белки, которые закодированы в так называемом комплексе гистосовместимости. Этот комплекс также называют человеческим лейкоцитарным антигеном. Белки HLA «атакуя» антиген, связываются с ним. Далее развивается иммунный ответ, который находится под контролем у ДНК. Каждый человек наследует локусы HLA от своих родителей, и такой набор локусов называется гаплотипом.
Иммунная система призвана защищать организм от внешних воздействий и внутренних нарушений, поэтому локусы HLA характеризуются очень высокой вариабельностью. Существует несколько тысяч вариантов белков, закодированных этим комплексом. По этой причине нельзя взять ткань одного человека и пришить её другому. При подборе доноров костного мозга и других органов и тканей важно найти совпадения гаплотипов. Совместимость донора и реципиента снижает вероятность развития реакции «трансплантат против хозяина» (РТПХ), увеличивает шансы на удачное приживление трансплантата и выздоровление пациента.
Применение микрочипа для HLA-типирования может быть и в других областях исследований. Изучение системы человеческого лейкоцитарного антигена важно для выявления причин невынашивания беременности, а также для изучения и прогнозирования эффективности иммунотерапии при онкологических заболеваниях. Локальный поиск полиморфизмов в локусах этого комплекса проводят для выявления врожденных заболеваний или предрасположенностей к некоторым заболеваниям.
Подбор пары донор-реципиент – длительный и сложный процесс. Существует ряд методов типирования локусов HLA. Например, широко использовался серологический метод, основанный на опосредуемой антителами цитотоксической реакции. Однако для подробного изучения донора и реципиента, наилучшими являются молекулярные методы анализа, которые определяют последовательность каждого локуса.
На сегодняшний день можно назвать четыре основных подхода к HLA-типированию: типирование с помощью сиквенс-специфичных праймеров (SSP) или сиквенс-специфичных олигонуклеотидов (SSO), а также секвенирование по Сенгеру и метод высокопроизводительного секвенирования.
Наш метод можно отнести ко второму подходу. Если описать его кратко, то на первом этапе проводится полимеразная цепная реакция и нарабатываются ДНК-фрагменты пациента, а на втором – гибридизация на микрочипе, где и происходят множественные специфичные реакции, которые позволяют определить локусы человеческого лейкоцитарного антигена. Считывание результатов происходит с помощью флуоресцентного сканера для микрочипов, обработка — с помощью программного обеспечения для анализа данных и интерпретации результатов, также разработанное нашей командой. Использование специально разработанного ПО исключит «человеческий фактор» при принятии решения.
Проект позволит упростить и сделать компактным масштабный процесс поиска однонуклеотидных замен, делеций и инсерций любого размера среди большого количества вариантов аллелей локусов HLA. Технология применима как для типирования низкого разрешения, так и для высокого, можно определять до 10 тысяч вариантов аллелей одновременно, что позволяет проводить типирование сразу по пяти локусам для одного пациента на одном микрочипе.
Конечно, о завершении разработки говорить пока рано. Необходимо провести сотни экспериментов на клинических образцах, подтвердить специфичность для каждого варианта аллелей HLA локусов. Кроме того, существует длительная процедура регистрации изделий медицинского назначения. Это процесс подготовки и согласования пакета технической документации с органами Росздрава, проведение технических и клинических испытаний. Он может длиться до полугода. Но реальность такова, что без регистрационного удостоверения медицинское изделие не будет востребовано.
В целом, заинтересованными в продукте могут оказаться не только отечественные центры поиска доноров костного мозга и медико-генетические центры России, есть перспектива выхода и на зарубежные рынки. Тем более, что предыдущий продукт на этой платформе, который предназначен для скрининга новорожденных, уже выведен и на европейский рынок в том числе. Эта технология может успешно конкурировать с другими производителями в условиях, когда точность и скорость определения играет важную роль.
Автор: Пензенцева Евгения, руководитель группы лаборатории молекулярной диагностики ГК Алкор Био
