Клетки насекомых Sf9 представляют собой клонов клеточной линии Sf21, полученной из ткани яичек мотылька Spodoptera frugiperda. Роль клеток Sf9 в получении рекомбинационного белка становится все более значимой, в особенности в сочетании с Экспрессирующей Бакуловирусной Векторной Системой (ЭБВС). Рост клеток Sf9 можно ускорить путем увеличения концентрации глюкозы, поэтому в данном случае рекомендуется применять культивирование с подпиткой.
Подобно клеткам млекопитающих, клетки насекомых демонстрируют более высокий уровень резистентности в отношении продуктов деструкции и более выраженную реакцию на стресс, что делает их оптимальным материалом для культивирования путем встряхивания легкими круговыми движениями в одноразовых мешках.
Приведенный пример демонстрирует процесс культивирования клеточной линии Sf9 в одноразовых мешках объемом 2 л в шейкере-инкубаторе Multitron Cell с системой ShakerBag Option (INFORS HT, CH-Bottmingen).
Технические характеристики Multitron Cell
- Наличие системы ShakerBag option;
- Амплитуда встряхивания − 50 мм;
- Прямая подача воздуха;
- Охлаждение;
- Возможность использования различных подставок (для одноразовых мешков, с кюветодержателями для колб и т.д.).
Спецификация
Клетки насекомых Sf9 культивировали в одноразовых мешках общим объемом 2 л (рабочий объем 1 л). Посевная концентрация колебалась в пределах 1,0 x 106 клеток/мл. Минимальный объем подпитываемых клеточных культур в больших мешках для культивирования составлял 25% от максимального рабочего объема камеры. Условия культивирования были следующие: температура 27°C, pH около 6. Клетки Sf9 обеспечивались воздухом посредством прямой подачи газа.
Подпитываемые культуры
- a) Питательная среда. Процесс культивирования клеток в одноразовой камере объемом 2 л был запущен со специально подобранным для данной цели планом подпитки, используя GIBCO Sf-900 II SFM (Invitrogen), безсывороточная среда, смешанная с Рluronic F-68 и глутаминовой средой. Данная питательная среда была разработана непосредственно для культивирования клеток насекомых; она отличается высокой концентрацией глюкозы.
- b) Одноразовый мешок объемом 2 л. Перенос посевной культуры в одноразовый 2 л мешок осуществлялся при концентрации клеток 1 x 106 на 1 мл с жизнеспособностью > 75% в 300 мл питательной среды SF-900 II SFM. Процесс культивирования занял в целом 10 дней. В первый день была произведена подпитка клеток 200 мл питательной смеси, в результате чего итоговый объем среды возрос до 500 мл. Далее, на второй и пятый дни эксперимента в мешок добавляли еще по 200 мл смеси, а на шестой день и далее объем подпитки сократили до 100 мл. В результате добавления питательной среды рабочий объем среды Sf-900 II SFM достиг 1 л.
Для обеспечения клеток кислородом в одноразовый мешок постоянно подавался воздух (1 об/об/мин). Клетки насекомых встряхивались на скорости 35 об/мин.
Анализ результатов
Клетки насекомых Sf9 в течение нескольких дней культивировали в одноразовых мешках объемом 2 л в шейкере-инкубаторе Multitron Cell с системой ShakerBag Option. В процессе культивирования клеток насекомых Sf9 производился отбор и анализ ежесуточной пробы с целью максимально точного сравнения уровней концентрации клеток, потребления субстрата и формирования промежуточных продуктов обмена веществ.
До тех пор пока питательная среда не достигла максимального рабочего объема 1 л, ежедневная постепенная подпитка свежей питательной средой обеспечивала рост клеток Sf9 с максимальной концентрацией жизнеспособных клеток 1,3 x 107 клеток на 1 мл и общей жизнеспособностью > 85% к седьмому дню культивирования. Потребление глюкозы наблюдалось в сравнении с ростом клеток; оно достигло лимитирующей концентрации на девятый день исследования. Процесс культивирования был завершен на десятый день после полного потребления субстрата и снижения уровня жизнеспособности клеток ниже 70% (Рис. 2).
Рис. 2: Сравнение плотности и жизнеспособности клеток, глюкоза и объем
Максимальная скорость роста клеток µmax, которой удалось достичь в ходе исследования, составила 0,6038 в сутки, а время удвоения td составило 27,55 ч. Максимальная концентрация клеток была зафиксирована на уровне 1,3 x 107 на 1 мл, при этом жизнеспособность клеток составила > 85% (Рис.3).
Рис. 3: Скорость роста клеток и время удвоения
Концентрации глюкозы и глутамина отображены на Рис. 4. Оба субстрата служили в качестве источника энергии для клеток насекомых Sf9 и потреблялись в процессе их роста. Параллельно со снижением объемов глюкозы и глутамина клетки будут производить промежуточные продукты обмена веществ, аммоний и глутамин. При увеличении концентрации аммония и глутамина среда может стать опасной для клеток. При наличии аммония может начаться процесс образования глутамина; это объясняет снижение объема аммония и неизменную концентрацию глутамина (Рис. 4).
Рис. 4. Промежуточные продукты обмена веществ при культивировании клеток Sf9
Выводы
- В ходе исследования был достигнут максимальный показатель концентрации клеток в размере 1,3 x 107 на 1 мл с жизнеспособностью > 85% в одноразовом мешке объемом 2 л и рабочим объемом 1 л.
- Оптимального уровня подачи субстрата можно достигнуть путем разработки специальной стратегии подпитки.
- Амплитуда встряхивания 50 мм обеспечивает аккуратное перемешивание клеточных культур.
- Одна секция шейкера-инкубатора Multitron Cell может быть использована для культивирования клеточных культур, рабочий объем которых составляет от 10 мл до 10 л. Таким образом, увеличение объема стартовых клеточных культур до мелкомасштабного производства возможно в одной единице оборудования.
