- вода питьевая как материал для получения воды очищенной. В основном проверяется сторонними организациями, например, водоканалом.
- вода очищенная – вода, полученная дистилляцией, обратным осмосом, деионизацией, ультрафильтрацией или комбинацией перечисленных методов, используемая в нестерильном фармацевтическом производстве.
- вода для инъекций, полученная дистилляцией в несколько этапов и предназначенная для растворения лекарственных веществ перед фильтрацией и для последнего ополаскивания первичной тары фармацевтической продукции, приготовляемой асептически.
Отбор проб
- Отбор проб проводится в определенных точках
- Пробы должны отбирать обученные работники, метод отбора проб должен быть задокументирован
- Пробы воды для проведения микробиологических анализов должны помещаться в стерильную тару
- Пробы воды в тот же день должны быть проанализированы в микробиологической лаборатории
- Пробы для определения эндотоксинов должны отбираться в специальную апирогенную тару
- Порядок пробоотбора – микробиология, эндотоксины, химический разбор, остальные анализы
Предельно допустимые показатели для исследуемой воды
WFI – вода для инъекций
Микробиологическая чистота – предельно допустимый показатель по Фармакопее — 10 КОЕ /100 мл (пример лимита действия — 1 КОЕ/100 мл)
Эндотоксины – макс. 0,25 МЕ / мл
PW – вода очищенная
Микробиологическая чистота – предельно допустимый показатель по Фармакопее – 100 КОЕ/1 мл (пример лимита действия — 30 КОЕ / мл)
Эндотоксины – макс. 0,25 МЕ/ мл
Лимиты тревоги и действия (для воды WFI и PW) устанавливаются на основании годового тренда на год вперед индивидуально для каждого производства. Если имеется несколько контуров воды, лимит действия устанавливается для каждого контура отдельно.
Микробиологическое определение
Определяется общее количество микроорганизмов в пробе установленного объема. Методикой первого выбора является фильтрование. В случае, если предполагается обнаружение большего количества микроорганизмов в воде, можно использовать альтернативный метод культивации пробы на агаровой среде.
Установление общего количества микроорганизмов – метод фильтрования.
- Используется стерильная фильтровальная аппаратура со стерильным мембранным фильтром с размером пор 0,45 ?м.
- Фильтрация проводится в контролируемой среде с использованием вакуумного насоса или центрального вакуума.
- Установленное количество контролируемой воды переливается в фильтровальное оборудование на мембранный фильтр, жидкость отфильтровывается, а мембранный фильтр при помощи стерильного пинцета переносится на поверхность агаровой среды.
- Количество воды для контроля — 200 мл воды для инъекций, 10 мл воды очищенной. Если ожидается высокое содержание микроорганизмов в воде очищенной, пробу необходимо перед анализом разбавить стерильной водой в соотношении 10x .
- Для установления общего количества бактерий в воде используется агаровая среда, предусмотренная Фармакопеей, способная поддерживать рост широкого спектра микроорганизмов (проводится подтверждающий анализ ростовых свойств)
- Инкубация фильтра на агаровой среде проходит в течение 5 дней при температуре 30 — 35°C.
Для фильтрации можно использовать оборудование Milliflex с одноразовыми простерилизованными фильтрами и воронками.
Установление общего количества микроорганизмов – метод подсчета на агаровой среде
- Стерильной пипеткой переносится по 1 мл анализируемой воды на 3 чашки Петри (? 9 см) с агаровой средой.
- Инкубирование, как и при фильтрационном методе.
Определение специфических микроорганизмов
Данная проверка не является обязательной, проводится для воды очищенной и устанавливает содержание Pseudomonas aeruginosa путем инкубации на цетримидовой агаровой среде. Это наиболее частый индикатор загрязненности фармацевтических вод.
Определение эндотоксинов
Основная информация
Бактериальные эндотоксины представляют собой липополисахариды (ЛПС) клеточных стенок грамотрицательных бактерий. Высвобождение ЛПС происходит после прекращения жизнедеятельности и аутолиза клетки.
Бактериальные эндотоксины имеют пирогенные свойства, т.е. при внутривенном введении вызывают повышение температуры тела и другие нежелательные реакции вплоть до шока и летального исхода.
Бактериальные эндотоксины составляют более 90% всех эндотоксинов. К пирогенам небактериальной природы относятся вирусы, грибки, антигены или синтетические адъюванты. С учетом опасности бактериальных эндотоксинов и трудности их удаления (химического и физического) из зараженного лекарственного препарата, необходимо принимать меры к минимизированию риска контаминации на фармацевтическом производстве.
Источниками бактериальных эндотоксинов на производстве лекарственных средств являются вода, персонал, некоторые виды сырья. Поэтому особое внимание уделяется проверке отсутствия эндотоксинов в воде на разных этапах ее получения. С учетом вышеизложенного устанавливают содержание эндотоксинов в воде для инъекций, используемой для производства парентеральных препаратов, и в воде очищенной, используемой в производстве субстанций для последующего приготовления парентеральных препаратов.
Существует два основных метода определения эндотоксинов
- Определение пирогенности на кроликах – установление всех пирогенов, включая эндотоксины
- ЛАЛ тест (Limulus Amebocyte Lysate Test) – устанавливает эндотоксины (не пирогены как таковые)
ЛАЛ тест
ЛАЛ тест является «in vitro» методом, основанным на свойствах амебоцитов гемолимфы мечехвостов. Наиболее часто встречающимся представителем мечехвостов является Limulus polyphemus, от которого и произошло название реактива. Из амебоцитов приготовляется очищенный лизат, который используется для определения бактериальных эндотоксинов.
Принцип метода:
Бактериальный эндотоксин активирует в присутствии двухвалентных ионов (Ca, Mg) фактор B, содержащийся в лизате. Это дает начало каскадной реакции, в результате которой образуется гель.
Фактор B Эндотоксин Активированный фактор B
Проэнзим Активированный фактор B Коагуляционный энзим
Коагулоген Коагуляционный энзим Коагулин + гель
Типы ЛАЛ теста
- Гелевый метод (оценивает возникновение геля, принцип лимитный или кинетический)
- Турбидиметрический метод (оценивает возникновение помутнения, принцип конечной точки «end-point» и кинетический)
- Хромогенный метод (оценивает возникновение окрашивания, принцип «end-point» и кинетический)
Гелевая методика является методикой первого выбора для определения эндотоксинов в воде.
Приготовление реактивов проводится согласно инструкции производителя набора (лизат + эндотоксин).
Лизат ЛАЛ
Лизат используется для установления эндотоксинов в неизвестных пробах. Чувствительность лизата обозначается буквой ? и указывается на каждом флаконе с лизатом.
Для фармацевтической воды (WFI или PW) максимально допустимое содержание составляет 0,25 МЕ/мл. В основном для установления данного лимита используется лизат с высокой чувствительностью ?=0,125.
Стандартный эндотоксин
Эндотоксин из набора используется для подтверждения приведенной чувствительности лизата, для валидации лабораторного метода и для приготовления ППК (позитивного продуктового контроля). Сила эндотоксина выражается в МЕ/мл или ЭЕ/мл. (МЕ – международная единица, ЭЕ – эндотоксиновая единица).
Эндотоксин растворяется в непирогенной воды согласно инструкции производителя таким образом, чтобы получился ряд 4, 2, 1, 1/2 и 1/4?, т.е. две более и две менее чувствительные концентрации, чем приведенная чувствительность ?.
Пробы
Подготавливается ряд проб согласно таблице:
| Раствор | Исходная концентрация эндотоксина в растворе, в который был добавлен эндотоксин | Количество пробирок |
| A | Нулевая / исследованный образец воды | 2 |
| B | 2 ?/ исследованный образец воды – ППК – позитивный продуктовый контроль | 2 |
| C | 2 ?/ вода для ЛАЛ – позитивный контроль | 2 |
| D | Нулевая / вода для ЛАЛ – негативный контроль | 2 |
Непосредственное определение
- В пробирки вносится по 0,1 мл приготовленных растворов
- Ко всем вышеперечисленным пробам добавляется по 0,1 мл растворенного лизата ЛАЛ
- Реакционная смесь смешивается и инкубируется в течение 60 минут при 37±1°C. После окончания реакции отсчитывается результат
Оценка теста
Пробирки осторожно переворачиваются на 180° и отслеживается образование геля
- Позитивная реакция – гель густой, не стекает по стенкам
- Негативная реакция – жидкий гель, жидкость
Результат считается удовлетворительным, если:
- Ни в одной из пробирок с растворами A и D (негативный контроль и пробы) не произойдет реакция
- В растворе C подтвердится указанная чувствительность лизата (позитивный контроль)
- В растворе B не установлена чувствительность лизата менее 0,5 ? (0,06 МЕ/мл) и более 2 ? (0.25 МЕ/мл) – исследуемый раствор в данных условиях не содержит интерферирующие факторы и не влияет на добавленный эндотоксин.
Яна Гаклова (Jana Haklov?), доктор наук
эксперт компании FAVEA
Источник: favea.org
