Растущий спрос на рекомбинантные белки привел к необходимости разработки высокопроизводительных методов культивирования и скрининга. Клеточные линии млекопитающих наиболее предпочтительны, но их трудно адаптировать к 96-луночному культивированию из-за большой потребности в кислороде и СО2.
Компания INFORS HT выпустила шейкер-инкубатор с амплитудой перемешивания 3 мм. При скорости перемешивания 800–1000 мин-1 удалось значительно увеличить выход рекомбинантных белков и уменьшить разброс данных по сравнению с культивированием с амплитудой перемешивания 25 мм. Данный результат можно объяснить ускорением роста и улучшенной жизнеспособностью клеток ввиду оптимальной циркуляции среды. Кроме того, было выполнено исследование различных типов уплотнений и платформ, что позволило загрузить до 40 96-луночных планшетов в один инкубатор. Таким образом, получили автоматизированную высокопроизводительную систему экспрессии белка, которая существенно сокращает время процесса.
Клеточная культура и трансфекция
В ходе всех экспериментов использовалась клеточная линия 293Е, суспензионная адаптированная линия HEK293. Культивирование проводилось во вращающихся колбах при следующих условиях: 37 °C, 5% CO2 и скорости перемешивания 150 мин-1. Смесь F-17 (Life Technologies) и SFM4 Transfix (GE Healthcare Life Sciences) в соотношении 1:1 использовалась в виде посевной и рабочей среды. Трансфекция осуществлялась с помощью 25-kDa линейного PEI (Polysciences) и очищенной плазмидной ДНК (Qiagen).
Дизайн эксперимента
Все эксперименты проводились на 96-луночных планшетах (Greiner Bio-One Masterblock) при двух скоростях перемешивания (800 и 1000 мин–1) и объемах наполнения (500 и 1000 мкл). Трансфекция осуществлялась при рабочем объеме 50 мл с последующим отбором аликвот в 96-луночный планшет. В определенный момент времени культуру извлекали из инкубатора и осветляли центрифугированием. Определение экспрессии белка в супернатанте проводилось с помощью ВЭЖХ.
Подсчет количества клеток и измерение концентрации белка
Образцы клеточной культуры из 96-луночных планшетов отбирались для анализа с 0 по 7 день культивирования. Для определения концентрации белка образцы супернатанта анализировались с помощью аффинного хроматографа (Agilent Technologies).
В ходе экспериментов с использованием шейкера с амплитудой 25 мм, помещенного в инкубатор, среднее значение выхода рекомбинантного белка составило 33 мкг/мл. При использовании шейкера-инкубатора INFORS HT Multitron Pro среднее значение выхода составило 276 мкг/мл. Последующий анализ различных белков подтвердил, что данная тенденция сохраняется для всех белков вне зависимости от целевых показателей выхода.
При культивировании клеток в шейкере-инкубаторе INFORS HT Multitron Pro были достигнуты стандартные показатели роста в сравнении с культивированием во вращающихся колбах. Клетки, культивирование которых проводилось в орбитальном шейкере с амплитудой 25 мм при скорости вращения 400 мин-1, не продемонстрировали заметный рост. Данный эффект можно объяснить различиями в значениях переноса кислорода.
Жизнеспособность клеток при использовании шейкера-инкубатора INFORS HT Multitron Pro была сравнима с жизнеспособностью клеток при культивировании во вращающихся колбах. Жизнеспособность клеток при использовании орбитального шейкера с амплитудой 25 мм при скорости вращения 400 мин-1 заметно снизилась через день после засева и продолжила снижаться на протяжении всего эксперимента
При использовании трех различных типов уплотнений не наблюдалось никаких существенных различий в значении выхода белка. При различных условиях культивирования концентрация белка была выше в планшетах с объемом заполнения 500 мкл по сравнению с планшетами с объемом заполнения 1000 мкл. Однако, принимая во внимание различия в общем объеме жидкости при различном наполнении, значения выхода, полученные при объеме заполнения 1000 мкл, были значительно выше. При различных условиях при увеличении скорости перемешивания с 800 мин–1 до 1000 мин–1 увеличивались значения выхода белка.
Определение скорости испарения
Провели сравнение значений испарения при различных типах герметизации: Duetz-System (Kuehner Technology), газопроницаемом мембранном уплотнителе (Axygen Scientific) и Microplate Box (INFORS HT). Испарение определялось по показателю изменения массы каждого планшета на протяжении 5 дней и было рассчитано с помощью метода линейной регрессии, далее для получения значения испарения в пересчете на одну лунку полученное значение делили на 96. Каждая лунка планшета заполнялась на 1000 мкл, перемешивание осуществлялось при 1000 мин–1 и амплитуде 3 мм в инкубаторе с влажностью 75%.
При сравнении трех коммерчески доступных типов герметизации планшетов были выявлены существенные различия в значениях остаточного объема жидкости после пяти дней культивирования с помощью INFORS HT Multitron Pro. Наименьшие потери на испарение наблюдались при использовании системы Duetz с последующем использованием Microplate Box (INFORS HT).
Использование мембранных уплотнителей привело к наивысшим потерям на испарение, которые составили примерно 30–40% в зависимости от различных форматов культивирования.
Использование шейкера-инкубатора INFORS HT Multitron Pro при скорости перемешивания 800–1000 мин-1 позволило существенно увеличить выход рекомбинантного белка и уменьшить разброс данных в каждой отдельно взятой лунке в сравнении с культивированием с амплитудой перемешивания 25 мм. Данный результат можно объяснить лучшим ростом и жизнеспособностью клеток вследствие оптимальной циркуляции среды. Кроме того, было выполнено сравнительное исследование культивирования при различных скоростях перемешивания, объемах заполнения планшетов и трех различных типах герметизации. Были определены следующие оптимальные параметры: объем заполнения – 1000 мкл, скорость перемешивания – 1000 мин-1, амплитуда перемешивания – 3 мм. Использование мембранного уплотнения с Рeg Тray позволило существенно увеличить выход продукта в данном эксперименте.
Полученные результаты наглядно демонстрируют высокую производительность разработанной системы для повышения экспрессии белка.