Передовые клеточные технологии: от науки к практике

0
3797

6-8 апреля 2016 года в Санкт-Петербурге пройдет международная конференция «Передовые клеточные технологии: от науки к практике» (CTERP).

Алексей Томилин
Алексей Томилин

Последние достижения в области стволовых клеток, включая плюрипотентные стволовые клетки, открывают широкие возможности для разработки новых лекарственных средств, клеточных продуктов для регенеративной медицины и трансплантологии, изучения механизмов возникновения заболеваний и лечения генетических болезней.

Конференция CTERP 2016 дает возможность ученым, представителям практической медицины, промышленности и бизнеса поделиться результатами фундаментальных исследований, обсудить положительный опыт и проблемы внедрения научно-исследовательских разработок в области создания новых лекарственных средств и методов клеточной терапии в медицинскую практику и производство.

Мы поговорили с председателем Программного комитета конференции – заведующим лабораторией молекулярной биологии стволовых клеток Института цитологии РАН, членом-корреспондентом РАН, доктором биологических наук Алексеем Томилиным о текущих вопросах, стоящих перед исследователями в области стволовых клеток, перспективных направлениях, а также об актуальности конференции CTERP в контексте перехода к практическому применению стволовых клеток в медицине.

Какие направления исследований сегодня наиболее актуальны для института?

Главное направление – это клеточная биология. Наверное, сегодня ИНЦ РАН – это лидирующий в этой области в России институт. Проводятся мультидисциплинарные исследования клетки, используются разные подходы: молекулярные, биофизические, биохимические, клеточно-биологические. Новая область, которую мы развиваем, является горячей темой в настоящий момент – это исследование плюрипотентных стволовых клеток. Значительная часть усилий в институте, в том числе за счет поддержки Российского Научного Фонда, будет направлена в область плюрипотентных стволовых клеток.

Расскажите, пожалуйста, о текущей ситуации в этой области

Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки – это стволовые клетки, полученные из каких-либо иных (соматических, репродуктивных или плюрипотентных) клеток путём эпигенетического перепрограммирования.  Плюрипотентные клетки могут дифференцироваться во все типы клеток, включая половые клетки, но исключая внезародышевые ткани.

Основную часть клеток организма составляют детерминированные клетки – обычно непролиферирующие, которые не обладают способностью дифференцироваться в другие клеточные типы. Соматические, в отличие от них, могут дифференцироваться. Такими клетками являются клетки фибробластов, гепатоциты печени, клетки крови, лимфоциты или Т-лимфоциты. В ходе раннего развития в организме человека происходит спецификация внезародышевых и зародышевых тканей. Тело человека формируется из ранних клеток, эти клетки – предшественники всех соматических, половых и прочих клеток во взрослом организме.

Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки были открыты Синья Яманака в 2006 году. Он использовал прямой подход: взял 24 фактора с плюрипотентностью и все их поместил в соматические клетки, и, таким образом, показал, что их можно репрограммировать. Потом он разбил эти 24 фактора на группы и нашел минимальные комбинации, способные репрограммировать плюрипотентные соматические клетки. Совокупность таких четырех факторов сейчас называется “коктейль Яманаки”.

Было несколько важных предпосылок для того, что сделал Яманака в 2006 году. Во-первых, это опыты по слиянию плюрипотентных и соматических клеток. Олег Леонидович Серов, один из участников конференции CTERP, первым в мире доказал, что при слиянии плюрипотентных и соматических клеток плюрипотентность является доминирующей. Она переносится на соматическое ядро и репрограммирует его. Это было подтверждено и в последующих опытах Остина Смита, которые также показали доминантность. В-третьих, предпосылкой явились опыты по клонированию овечки Яном Вильмутом. Он показал, что соматическое ядро в принципе может быть репрограммировано до исходного эмбрионального состояния. Другой важной предпосылкой открытия, сделанного Яманака, стало открытие фактора Oct-4 Хансом Шолером, лекция которого будет открывать нашу конференцию. Если другие  факторы заменяемы, то экспрессия Oct-4 – это черта, присущая плюрипотентности.

Таким образом, идея о том, что соматическое ядро можно репрограммировать, на тот момент уже висела в воздухе.

Зачем нам нужны стволовые клетки? Как они применяются?

Существует два применения индуцированных плюрипотентных стволовых клеток.

Первое – скрининг новых лекарственных препаратов и моделирование заболеваний человека в чашке Петри, таких как заболевания печени, мышечная дистрофия, кардиоваскулярные заболевания. В сотрудничестве с ФГБУ «СЗФМИЦ им. В. А. Алмазова» Минздрава России проводится моделирование некоторых генетически наследуемых заболеваний сердца.

Их клиническое применение находится ещё только в начальной стадии, но плюрипотентные клетки здесь очень важны по нескольким причинам. Клетки, которые несут в себе болезнь, сложно перевести в культуру и поддерживать там, чтобы затем изучать лекарственные факторы и механизмы этой болезни.

В стандартных условиях сложно моделировать болезнь и заниматься поиском лекарственных препаратов, а также изучать механизмы этой болезни и исправления дефекта. Допустим, нейроны. Нейроны от пациента получать крайне сложно: их мало, они деградируют, их сложно перевести в культуру. А используя такую методику, можно взять любую доступную соматическую клетку, репрограммировать её и получить необходимый для исследований материал.

Происходит это так: у пациента с каким-то заболеванием, например, болезнью Альцгеймера или Паркинсона, получают доступные соматические клетки, например, фибробласты кожи. Затем их репрограммируют с помощью коктейля Яманаки, получают в результате плюрипотентные клетки, и уже эти iPS клетки дифференцируют в культуре в клетки,  необходимые для изучения нужных процессов.

Второе перспективное применение индуцированных плюрипотентных стволовых клеток – это возможность их использования в клеточной терапии.

От пациентов, страдающих каким-либо дегенеративным заболеванием, получают соматические клетки и репрограммируют их в коктейле Яманака в iPS клетки. Затем их дифференцируют в необходимые соматические клетки, которые заменят страдающую или отсутствующую популяцию. На этапе iPS клетки возможны генетические манипуляции: можно исправлять дефекты, вводить дополнительные гены, трансгены и так далее. Область применения – тканезаместительная терапия и регенеративная медицина. Использование iPS клеток в лечении деградации сетчатки глаза – это один из первых описанных в научной литературе случаев, где успешно применены iPS клетки для тканезамещения. Думаю, в пределах пяти лет появятся первые примеры эффективного лечения.

Что изменилось за последние несколько лет в области исследований плюрипотентных стволовых клеток?

Изучены механизмы репрограммирования. Показано, что есть стохастическая и детерминистическая фазы репрограммирования. Изучены генетические факторы, которые генетически и эпигенетически контролируют этот процесс. Разработаны методы эффективного репрограммирования, более детально изучены механизмы, а также расширен спектр заболеваний человека, которые можно моделировать.

Удалось ли решить проблему, связанную с тем, что плюрипотентные клетки не приживались? Эта проблема до сих пор актуальна?

Да, по-прежнему актуальна. Возможно, она была слегка преувеличена, поскольку дифференцированная культура у человеческих клеток более длительная и надежная. Там проблема остаточных недодифференцированных плюрипотентных клеток стоит не так актуально, как в случае с мышами, например.

Тем не менее, проблема пока не решена, так что мы предложили «суицидальную» технологию. Она работает и реализуется пока ещё на модельных плюрипотентных клетках, такие как мышиные iPS клетки или мышиные эмбриональные стволовые клетки. Мы используем разные векторы для доставки «суицидального» гена. Используем либо трансгены, либо антивирусы, либо новый тип векторов  – искусственные хромосомы человека. Они хороши тем, что стабильно поддерживаются, не интегрируют геном, тем самым, устраняют риск инсерционного мутагенеза и обеспечивают стабильную экспрессию гена-самоубийцы. В случае если какая-то популяция, полученная в культуре, содержит остаточные плюрипотентные клетки, даже если они попадут в организм и дадут начало опухоли, мы можем подавить рост этой опухоли введением ганцикловира – лекарственного препарата, убивающего клетки, которые экспрессируют ген-самоубийцу. Ген-самоубийца сам по себе не убивает клетки, а только при воздействии этого препарата.

Таким образом мы активируем ген-самоубийцу?

Да, мы предоставляем субстрат для продукта этого гена, который превращается в токсическую субстанцию, убивающую клетку. Ген-самоубийца находится под контролем энхансера гена Oct-4, мы запускаем его экспрессию, и это позволяет селективно убивать недифференцированные клетки и не трогать дифференцированные.

Сейчас используются также другие подходы для решения этой проблемы с наличием в культуре остаточных недифференцированных клеток. Например, на основе искусственных хромосом японского исследователя Ошимура. Этот способ запускает экспрессию MHC (главный комплекс гистосовместимости). Иммунная система узнаёт клетки и атакует их, если они экспрессируют МНС. Естественно, МНС можно также поставить под контроль плюрипотентных промоторов и, таким образом, селективно уничтожать недифференцированные клетки и не трогать дифференцированные. Таким образом, мы можем использовать свойства иммунной системы.

Технически это сложнее, чем предыдущий способ?

Технически – это то же самое, что и суицидальный ген, я не вижу особой разницы. Ганцикловир, который используется для этого, одобрен для лечения вирусных инфекций, его можно использовать на человеке. То же самое лекарство вызывает гибель клеток и запускает экспрессию гена-самоуйбицы. Сейчас это находится в стадии разработки, но я думаю, в ближайшие пять лет это уже появится. Сейчас известны примеры лечения сетчатки, думаю, это будет лавинообразно расширяться.

Расскажите, пожалуйста, про конференцию CTERP. Почему она была создана и в чём её актуальность в настоящее время?

Сейчас в мире проводится множество конференций, мы все имеем возможность принимать в них участие. Но, на мой взгляд, России тоже необходимо заявить, что она активно работает в этой области, привлечь сюда ученых с мировым именем, дать возможность молодым ученым послушать ученых, многие из которых стояли у истоков.

Тема стволовых клеток была и остается актуальной, и наша конференция – одна из многих, которые проводятся на эту тему. Но для нас было важно организовать международную  конференцию с привлечением ведущих докладчиков из-за рубежа, чтобы наши исследователи, студенты и аспиранты имели возможность с ними общаться. Это в значительной степени популяризует нашу область. Конференция будет англоязычной. Мы хотим показать нашу экспертизу, услышать что-то новое, обменяться мнениями. В конференции также примут участие клиницисты. Они посмотрят и узнают, насколько далеко продвинулась эта область в плане регенеративной медицины.

Расскажите, пожалуйста, о программе конференции?

Конференция продлится три дня. Первые два дня полностью посвящены плюрипотентным клеткам. Основным докладчиком у нас будет Ханс Шолер, который открыл Oct-4 – один из факторов, необходимых для поддержания и индукции плюрипотентности. Он будет открывать конференцию.

Следующий день будет посвящен также плюрипотентным клеткам, докладчиками будет охвачено практически каждое направление.

Наконец, в третий день конференции у нас будут доклады по нейрональным, гемопоэтическим, мезенхимальным и взрослым мультипотентным стволовым клеткам.

Во второй половине третьего дня пройдут доклады, посвященные прикладным аспектам, где, в том числе, будут представители консорциума GAiT (Global Alliance for iPSC Therapies). Среди участников будут Марк Тёрнер и Жаклин Бэрри – это исследователи, более ориентированные уже на биотехнологии и конкретное получение iPS клеток в GMP условиях, а также на их применение как раз для тканезаместительной терапии. Участники консорциума достаточно опытны, и, на мой взгляд, мы многое можем перенять у них в вопросах эффективности получения iPS клеток, контроля качества и GMP условий. Руководствуясь принципами, которые вырабатываются консорциумом, мы будем у нас в Институте цитологии РАН строить новую лабораторию по GMP стандартам, нацеленную в первую очередь на тканезаместительную терапию.

Моделирование заболеваний не требует GMP условий, необходимо просто поддерживать все в чистых  условиях, не вносить микроплазму и прочие патогены, чтобы это не влияло на результат опыта. А GMP – это стандарт качества производства продукта, который уже будет использован человеком. Там совершенно другие стандарты и критерии. К тому же, когда мы получили необходимое количество iPS клеток, мы должны их отобрать и доказать, что это качественные iPS клетки. Это очень дорогостоящая кропотливая работа.

Планируются ли на конференции какие-то интересные доклады? Возможно, о каких-то новых наработках?

Следует учесть, что область исследований стволовых клеток настолько конкурентная, что многие серьезные ученые, которые в ней работают, не готовы подвергать риску усилия и деньги, вложенные в исследования, и анонсировать их, по крайней мере, до принятия результатов в печать. Тем не менее, я думаю, что на конференции будут представлены интересные доклады и неопубликованные материалы.

Я покажу весьма необычные результаты, касающиеся неканонических функций генома Oct-4. Сотрудничество с нашими коллегами в  Университете Вирджинии показало, что у Oct-4 есть весьма важные неканонические функции, которые касаются атеросклероза – причины смертности номер один у человека.

Наши данные показывают, что Oct-4 – фактор, необходимый для поддержания индукции в плюрипотентных клетках, оказывается, играет протективную роль в развитии атеросклероза, и это показано генетическими исследованиями. К примеру, у нас есть мышь, в которой мы индуцируем атеросклероз и в которой отсутствует Oct-4. В отсутствие Oct-4 бляшки выглядят по-другому: они имеют другой состав и более склонны к мобильности. Естественное развитие атеросклероза и последующий отрыв бляшки – самая главная опасность и причина смертности от кардиоваскулярных заболеваний.

Так вот наши совместно полученные данные показывают, что Oct-4 несет именно атеропротективные свойства. На периферии кровеносных сосудов есть популяции так называемых гладкомышечных клеток. При развитии атеросклеротической бляшки, эти клетки переключают свой фенотип, мигрируют туда и улучшают ее свойства. Выяснилось, что в отсутствие Oct-4 миграции гладкомышечных клеток туда не происходит, и бляшка становится более злокачественной, склонной к отрыву.

Таким образом, эти данные довольно неожиданные и меняют представления об Oct-4 только как о центральном регулировщике плюрипотентности, расширяя его функции и на регуляцию клеточной пластичности соматических клеток.

В чем, на ваш взгляд, миссия конференции CTERP?

В известной степени цель конференции – популяризовать науку, изменить к ней отношение в обществе и привлечь новое финансирование. Для меня совершенно очевидно, что за плюрипотентными стволовыми клетками будущее, как в плане моделирования заболеваний, так и в регенеративной медицине. Мы можем потерять 5-10 лет, но потом всё равно придем к тому, что нам нужны iPS клетки. Их клиническое применение неизбежно, и Россия должна принимать в этом активное участие. Поэтому мы считаем правильным заниматься этим сейчас. Конференция CTERP, организованная Институтом  цитологии РАН и компанией ОПТЭК – это, безусловно, движение в этом направлении.

Большое спасибо